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快速掌握三代測序有哪些我們不能忽視的質控點
來源: | 作者:201321492800086 | 發布時間: 205天前 | 415 次瀏覽 | 分享到:
測序技術經過第一代、第二代的發展,讀長從一代測序的近1000bp,降到了二代測序的幾百bp,通量和速度大幅提升,而第三代測序的發展思路在于保持二代測序的速度和通量優勢的同時,彌補其讀長較短的劣勢。三代測序與前兩代相比,最大的特點就是單分子測序,測序過程無需進行PCR擴增。


測序技術經過第一代、第二代的發展,讀長從一代測序的近1000bp,降到了二代測序的幾百bp,通量和速度大幅提升,而第三代測序的發展思路在于保持二代測序的速度和通量優勢的同時,彌補其讀長較短的劣勢。三代測序與前兩代相比,最大的特點就是單分子測序,測序過程無需進行PCR擴增。

那么三代測序當中會有哪些質控點呢?下面我們以PacBio為例為大家作以簡單敘述:

與二代測序一樣,PacBio三代測序的第一步也是核酸提取,其次是建庫,其最主要的區別是建庫過程中不涉及PCR反應。DNA分子打斷之后,經過修復、接頭連接、純化和聚合酶綁定,即可出庫準備上機測序。


質控點一:基因組DNA或Total RNA


目前市場上的核酸提取大部分都是靠儀器去完成的,當然樣本量少的情況下我們也會手動提取,因樣本或提取試劑盒差異或多或少都會出現提取失敗的情況,有時候也會因保存不當發生樣本降解的情況,這時候就需要對提取后核酸進行質控了。

傳統的質控方法是先對樣本進行定量,濃度合格后再進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,很是費時費力。全新的毛細管電泳技術是一種以毛細管為分離通道、高壓直流電場為驅動力的新型核酸分離技術,相較于傳統的瓊脂糖凝膠電泳而言,具有高效、快速、成本低、應用模式開放等顯著優勢,目前已在分子生物學領域迅速推廣開來。小編今天為大家介紹的就是這樣一款Qsep全自動毛細管電泳儀(圖1),無需配膠加染料,無需進行凝膠成像,輕輕松松就可獲得想要的結果。


以下圖例為Qsep全自動毛細管電泳儀檢測的實驗結果圖。對基因組DNA(圖2)來說,它可以直觀的看到片段大小及降解程度,并提供DQN值(1-10分)對基因組DNA進行完整性評估;對Total RNA(圖3)來說,除了直觀呈現18s和28s峰型分布和占比之外,同樣也會有標準化評估的RQN值(1-10分),分值越高代表完整性越好。



質控點二:打斷后的DNA片段及片段篩選后的文庫

例1:在基因組測序文庫構建過程中,要先將基因組DNA打斷破碎成大片段(通常是20kb左右),之后經過末端修復、接頭連接、片段篩選、雜交測序引物和DNA聚合酶綁定(圖 4)等步驟,我們的SMRT Bell DNA文庫就制備成功了。那打斷后的DNA及片段篩選后的文庫(圖5)是否是我們想要的大小呢,會不會有小片段殘留,都可以通過Qsep全自動毛細管電泳儀來進行質控,它目前可以測到的最大片段為165k(圖6)。整個文庫構建過程沒有經過PCR,這也是三代基因組測序文庫構建的最大亮點!



例2:在全長轉錄組測序文庫構建中,也可以用Qsep全自動毛細管電泳儀來進行質控,它的文庫制備要相對較為復雜那么一點。首先,我們需要從總RNA中篩選獲得polyA(+)RNA,之后利用SMARTerTMPCR cDNA Synthesis Kit進行反轉錄合成cDNA。cDNA合成后需要使用KAPA HiFi PCR Kit進行PCR擴增,擴增后按片段大小對cDNA進行分選,為保證獲得足夠量的cDNA進行后續建庫測序,分選后cDNA片段經過PCR再次擴增,之后經過末端修復、接頭連接、片段篩選、雜交測序引物和DNA聚合酶綁定就可以上機測序了(圖7)。


質控點三:數據質量

與二代測序的堿基質量標準Q20/Q30不同,三代測序由于其隨機分布的堿基錯誤率,其單堿基的準確性不能直接用于衡量數據質量。那么,怎么判斷三代測序的數據好不好呢?

在上游實驗環節,最關鍵的影響因素是文庫的構建。高質量的文庫產出的數據長度長,質量好;而低質量的文庫產出的數據長度短,質量差。其次,就是看比例,需要關注有兩個比例:一個是subreads與polymerase reads數據量的比例,比例過低反映測序過程中的低質量的序列較多;一個是zmw孔載入比例,根據孔中載入的DNA片段數分為P0、P1和P2,P1合理比例在40%-60%之間,上樣濃度異常會導致P0或P2比例過高,有效數據量減少。不管是二代還是三代測序,想要下機數據好,前期的步步質控是關鍵。


 
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