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臨床基因檢測第一關,嚴把提取樣品質量關
來源: | 作者:201321492800086 | 發布時間: 9天前 | 56 次瀏覽 | 分享到:
二代、三代測序(NGS)的文庫制備過程,對測序結果的影響很關鍵,而文庫質量的好壞除建庫方法和過程細節外,最重要的是初始樣本質量。如何準確評估分離的核酸樣品的質量確定樣品是否具有足夠高的質量?見下文案例。
【導語】二代、三代測序(NGS)的文庫制備過程,對測序結果的影響很關鍵,而文庫質量的好壞除建庫方法和過程細節外,最重要的是初始樣本質量。如何準確評估分離的核酸樣品的質量確定樣品是否具有足夠高的質量?見下文案例。

■ 核酸質量評分:DNA


通過計算基因組質量評分(DQN),可以高效地評估gDNA的質量。由Qsep開發用于片段分析儀,數據分析軟件評估每個樣品與用戶定義的特定應用閾值用于“高質量的DNA”,并指定0到10之間的DQN值。數值反映高于定義的閾值的DNA的百分比。


圖1:不同DQN評分的基因組樣本



■ 核酸質量評分:RNA


有兩個指標可用于評估RNA的質量,軟件計算RNA質量數(RQN),相當于RNA完整性數(RIN),RIN是廣泛接受的總RNA完整性和質量指標。與RIN值類似,RQN值范圍為1到10, 是基于專有的計算算法,考慮RNA電泳圖譜的整個分布。


圖2:不同RQN評分的RNA樣品


盡管RIN / RQN值是從新鮮組織分離的RNA的質量的可靠評價標準,但它們并不是降解福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)樣品的RNA質量的十分有效的評價標準。為了解決這個問題,Illumina的科學家開發了DV200這個檢測標準,它可以計算RNA片段大于200nt大小的百分比。考慮到DV200值和二代文庫產量之間的更強的相關性,與RQN值相比,DV200的評價對于評估FFPE RNA質量是更為理想的。



圖3:不同DV200評分的FFPE RNA 樣品



■ 基因組DNA和FFPE DNA


使用DNA卡夾檢測所測樣品后,Qsep軟件可以自動準確地測定gDNA樣本的大小和DQN。


DNA在福爾馬林固定過程中經歷了大量的化學修飾,包括與蛋白質交聯和降解成較小的片段。從FFPE樣品中分離出的DNA質量因固定方法和標本組織年齡的不同而有很大差異。使軟件中Smear功能可以對降解的FFPE DNA進行質量評估(如下圖,以1k為閾值)。它們提供DQN值進行簡化的質量評估,用于指導以下內容:


  1. 第一次擴增中使用的PCR循環次數

  2. 打斷所用的條件

  3. 文庫構建的質量


圖4:FFPE樣本檢測DQN情況對比



其后對這四個樣品進行分批次建庫,多批次結果均一致,對文庫用Qsep進行片段檢測,結果如下圖。

圖5:對應樣本的文庫質控結果



如圖所示,質量評分最低的最后一個樣本,所構建文庫大小顯著偏小,引物二聚體殘留較多,此外文庫濃度也是4個文庫中最低,且多批次一致。因此文庫質量的好壞除建庫方法和過程細節外,最重要的還是初始的樣本質量。文庫質量的高低也影響了后續測序的結果以及數據的結果,因此做好提取樣品的質控是第一步,也是最關鍵的一步。



■ 建庫前樣品


在文庫構建前對樣品進行片段打斷時可以對打斷的樣品進行一次質控,用于檢測打斷的條帶是否滿足預期需求,以確定是否需要改變打斷的條件。

圖6:打斷樣品的檢測圖



可通過軟件Smear功能來確定片段的主要分布區間,以期得到最佳打斷打斷效果。

腫瘤液態活檢中游離核酸提取質量的質控也是目前相對比較熱門的方向,不少用戶使用Qsep系列來檢測cfDNA樣品,Qsep系列可以達到pg級的檢測靈敏度,對于cfDNA樣品的檢測相對輕松,可以準確測定樣品的目的區域和大片段核酸的分布比例。

圖7:cfDNA樣品的檢測圖



單細胞測序中RNA反轉錄后的產物cDNA樣品的檢測,通過檢測cDNA的片段分布來定是否能進行文庫構建。

圖8:cDNA樣品的檢測圖



■ 文庫


不同的二代測序文庫根據測序儀的讀長需求會有不同的大小分布,軟件可以根據調點的分布準確的測定條帶的分布區間,使用Smear分布功能,可以準確計算文庫的平均片段以及主要片段集中區域。

圖8:文庫的片段分布檢測圖



Qsep系列全自動毛細管電泳儀采用可拋棄式的預制膠卡夾,即插即用,全自動進樣,無須人工制膠、灌膠、上樣,免去了手工制膠的繁瑣,能讓一般用戶在短時間內學會操作系統,并自動分析樣品得出結果。也可用于DNA、RNA和蛋白檢測 ,通量靈活,可處理1-100個任意個數樣本。且具有單通道和四通道型號儀器,可滿足不同用戶需求,單次使用樣本量極少,且最低檢測限為pg級。

圖9:不同通量的Qsep系列全自動毛細管電泳儀


在高通量測序中進行全程的樣品質控中,Qsep系列全自動毛細管電泳儀為穩定高質量的數據產出提供了保證,讓文庫的構建的每一步都可以清晰的進行回溯。

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